Wpływ zolpidemu na funkcje poznawcze po stanie padaczkowym

Czy zolpidem może przywrócić funkcje poznawcze po SE?

Status epilepticus (SE) wiąże się z pogorszeniem funkcji poznawczych z powodu uszkodzenia różnych obszarów mózgu, w tym hipokampa – struktury odpowiedzialnej za procesy uczenia się i pamięci. Szkodliwe efekty SE na hipokamp manifestują się poprzez liczne zmiany neuropatologiczne, takie jak utrata neuronów, astroglioza, neurozapalenie, nieprawidłowa neurogeneza i reorganizacja synaptyczna. Coraz więcej dowodów wskazuje na potencjalne korzyści terapeutyczne zolpidemu – leku o działaniu nasennym i uspokajającym – w ułatwianiu regeneracji po urazach mózgu, po przypadkowym odkryciu jego paradoksalnych efektów w 2000 roku. Liczne badania konsekwentnie wykazują zdolność zolpidemu do przywracania różnych funkcji fizjologicznych, takich jak poprawa funkcjonalnej łączności mózgowej, przepływu krwi w mózgu, aktywacja uśpionych obszarów mózgu oraz poprawa zaburzeń behawioralnych i funkcji poznawczych.

Zolpidem działa na receptory GABA typu A (GABAARs) poprzez modulowanie ich funkcji w obecności GABA. W normalnych warunkach fizjologicznych, aktywacja GABAAR pozwala jonom Cl^– przepływać do neuronu zgodnie z gradientem elektrochemicznym, prowadząc do hiperpolaryzacji neuronu. Gradient elektrochemiczny Cl^– jest utrzymywany głównie przez działanie kotransporterów kation-chlorek (CCCs), w szczególności kotransportera Na⁺-K⁺-Cl^– (NKCC1) i kotransportera K⁺-Cl^– (KCC2), które odpowiednio wprowadzają i usuwają Cl^– z komórki. KCC2 jest dominująco ekspresjonowany w większości dojrzałych neuronów ośrodkowych, podczas gdy NKCC1 jest ekspresjonowany zarówno w niedojrzałych, jak i uszkodzonych neuronach ośrodkowych. KCC2 pomaga usuwać Cl^– z neuronów, zmniejszając wewnątrzkomórkowe stężenie Cl^– i promując napływ Cl^– podczas aktywacji GABAAR.

Jednak w pewnych warunkach, takich jak padaczka, ekspresja KCC2 jest obniżona, a NKCC1 podwyższona, odwracając gradient elektrochemiczny Cl^– i prowadząc do wyższego stężenia Cl^– wewnątrz neuronów niż w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. W konsekwencji, aktywacja GABAAR prowadzi do wypływu netto Cl^–, co depolaryzuje neurony i zmienia rolę GABAAR z hamującej na pobudzającą. Ta depolaryzacja zależna od GABAAR może być modulowana lub wzmacniana przez różne leki modulujące receptory, w tym zolpidem. Ta hipoteza może wyjaśniać paradoksalne efekty zolpidemu w promowaniu wybudzania i poprawy behawioralnej, szczególnie w przypadkach urazów mózgu. Ben-Ari zasugerował, że efekty wybudzania zależne od zolpidemu w urazie mózgu mogą wynikać z przesunięcia hamującej transmisji GABAergicznej do pobudzających neuronów, co jest głównie determinowane przez wewnątrzkomórkowe stężenie Cl^– i synergistyczne role NKCC1 i KCC2.

Jak zaprojektowano badanie modelu SE i ocenę funkcji mózgu?

W niniejszym badaniu opracowano model szczurzy status epilepticus indukowany litem i pilokarpiną, z zastosowaniem litu, optymalnej dawki pilokarpiny, ksylazyny oraz koktajlu lekowego zawierającego diazepam i MK-801. Test labiryntu wodnego Morrisa (MWM) zastosowano do oceny potencjału zolpidemu w zakresie poprawy uczenia się i pamięci, wraz z jego wpływem na zachowania lękopodobne i funkcje motoryczne. Przeprowadzono ilościową analizę histologiczną w celu oceny grubości warstwy komórkowej i bezwzględnej liczby komórek w głównych warstwach komórkowych regionów hipokampa CA1 i CA3 u szczurów z indukowanym przez lit i pilokarpiną status epilepticus, przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną. Dodatkowo, przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i kwantyfikację fluorescencji, aby zbadać wpływ zolpidemu na ekspresję białek KCC2 i NKCC1 w tych regionach.

Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Universiti Sains Malaysia. Wykorzystano ośmiotygodniowe samce szczurów Sprague-Dawley, ważące 250-300 g, które były trzymane w kontrolowanym środowisku, w temperaturze pokojowej, ze standardowym cyklem światło/ciemność 12:12, z dostępem do granulatu pokarmowego i wody ad libitum. Badanie trwało 26 dni, rozpoczynając się od wstrzyknięcia chlorku litu (LiCl) w dniu 1 i kończąc przygotowaniem próbek mózgu w dniu 26.

Wszystkim szczurom podano dootrzewnowo (i.p.) LiCl (127 mg/kg) 16-24 godziny przed podaniem chlorowodorku pilokarpiny. Następnego dnia pilokarpinę podawano dootrzewnowo co 30 minut w dawkach 20 + 10 + 10 + 10 mg/kg, do maksymalnej skumulowanej dawki 50 mg/kg, aż do wywołania SE. Status epilepticus charakteryzował się ciągłymi napadami limbicznymi trwającymi co najmniej 30 minut, osiągającymi stadium 4 lub 5 w skali Racine’a. Tylko szczury, które rozwinęły trwały SE, zostały włączone do dalszych eksperymentów. Aby zakończyć SE, szczurom najpierw wstrzyknięto 2,5 mg/kg ksylazyny. Po pozostaniu w stanie zmodyfikowanym ksylazyną przez godzinę, podano im koktajl lekowy składający się z 2,5 mg/kg diazepamu i 0,1 mg/kg MK-801 dootrzewnowo, aby całkowicie zatrzymać SE. Szczury miały czas na regenerację podczas okresu ponapadowego (dni 3-19).

Szczury poddano testowi MWM w celu oceny wpływu zolpidemu na uczenie się przestrzenne i odzyskiwanie pamięci. Ponadto oceniono wpływ zolpidemu na zachowania lękopodobne i funkcje motoryczne. Zachowania lękopodobne mierzono czasem spędzonym i długością ścieżki na obwodzie basenu, natomiast funkcje motoryczne oceniano za pomocą średniej prędkości pływania. Szczury podzielono na cztery grupy: Kontrola_Placebo, Kontrola_Zolpidem, SE_Placebo i SE_Zolpidem. W zadaniu MWM szczury przeszły 60-sekundowy dzień habituacji, po którym nastąpiły cztery dni treningu z czterema 60-sekundowymi próbami każdego dnia oraz 60-sekundowa próba końcowa ostatniego dnia.

Podczas habituacji szczury mogły swobodnie pływać w basenie przez 60 sekund. Podczas okresu treningowego rejestrowano czas potrzebny każdemu szczurowi na dotarcie do platformy. Szczury, które nie znalazły platformy, były delikatnie prowadzone na nią przez eksperymentatora i mogły pozostać tam przez 10 sekund przed przeniesieniem do klatki kwarantanny w celu wysuszenia.

Podczas próby końcowej szczurom podawano zolpidem (2,5 mg/kg, i.p.) lub placebo (0,9% sól fizjologiczna) 30 minut przed rozpoczęciem próby. Dawkę zolpidemu wybrano na podstawie krzywych dawka-odpowiedź wskazujących, że 50% efektywna dawka (ED50) zolpidemu dla upośledzenia zachowania lokomotorycznego u myszy i szczurów waha się od 1,0 do 2,5 mg/kg. Następnie szczury wypuszczano z północnego wschodu. Czas spędzony w docelowym kwadrancie południowo-wschodnim był nagrywany i analizowany za pomocą oprogramowania do śledzenia behawioralnego. Dodatkowo analizowano czas spędzony i długość ścieżki na obwodzie, wraz ze średnią prędkością, w celu oceny zachowań lękopodobnych i funkcji motorycznych. Do analizy basen podzielono na osiem stref (północno-wschodnią, południowo-wschodnią, południowo-zachodnią i północno-zachodnią), z każdym kwadrantem podzielonym na strefy wewnętrzne i zewnętrzne.

Jakie zmiany zachodzą w strukturze hipokampa po SE?

W 26. dniu szczury uśmiercono przy użyciu CO₂ i poddano perfuzji całego ciała 0,9% solą fizjologiczną, a następnie 4% paraformaldehydem (PFA). Mózgi utrwalono w 10% buforowanej formalinie obojętnej (NBF) w temperaturze 4°C przez 48 godzin, a następnie umieszczono w 70% etanolu. Przekrój czołowy potwierdzono poprzez wizualizację całego grzbietowego hipokampa (Bregma -2,5 i -4,5 mm). Skrawki tkanek utrwalono, odwodniono, oczyszczono i zatopiono w parafinie, a następnie pocięto na grubość 5 μm.

Skrawki tkanek odparafinowano i nawodniono przed barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E), które przeprowadzono przy użyciu hematoksyliny i eozyny. Zabarwione skrawki zamontowano i przykryto szkiełkiem nakrywkowym z DPX. Tkanki poddano również sekwencyjnemu podwójnemu znakowaniu fluorescencyjnemu białek KCC2 i NKCC1. Najpierw odparafinowano je ksylenem, a następnie stopniowo nawodniono zmniejszającymi się stężeniami etanolu. Przeprowadzono odzyskiwanie antygenów indukowane ciepłem (HIAR) przy użyciu roztworu do odzyskiwania antygenów na bazie cytrynianu (pH 6,0). Tkanki zablokowano 3% normalną surowicą kozią (NGS) i normalną surowicą oślą (NDS). Następnie tkanki inkubowano z przeciwciałem pierwotnym króliczym przeciwko KCC2 przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia tkanki inkubowano z przeciwciałem wtórnym kozim przeciwko IgG królika. Po przemyciu PBS tkanki barwiono na NKCC1. Następnie inkubowano je z przeciwciałem pierwotnym kozim przeciwko NKCC1 przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubowano z przeciwciałem wtórnym oślim przeciwko IgG kozy. Na koniec tkanki przemyto PBS i zamontowano z Fluoroshield^TM zawierającym 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) przed przykryciem szkiełkiem nakrywkowym.

Obrazy mikroskopowe histologiczne i fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu, zsynchronizowanego z oprogramowaniem do obrazowania Olympus cellSens. W przypadku fluorescencji, wzbudzenie przy różnych długościach fal fluoroforów osiągnięto za pomocą palnika rtęciowego, ustawionego na 358 nm (niebieski), 488 nm (zielony) i 594 nm (czerwony). Czas ekspozycji dla akwizycji obrazu ustawiono na 500 ms zarówno dla kanału czerwonego, jak i zielonego. Barwienie jądrowe hematoksyliną i DAPI wykorzystano do identyfikacji regionów hipokampa będących przedmiotem zainteresowania (ROI), w szczególności CA1 i CA3.

Analizy mikroskopowe podregionów hipokampa CA1 i CA3 przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ zarówno dla histologii, jak i kwantyfikacji fluorescencji. Struktury identyfikowano zgodnie ze standardowymi kryteriami anatomicznymi. W przypadku barwienia H&E zmierzono grubość struktury i bezwzględną liczbę komórek w warstwach komórek piramidowych (PCL) CA1 i CA3. W każdym podregionie wybrano trzy losowe regiony zainteresowania (ROI) (0,253 mm² na ROI) do kwantyfikacji liczby komórek. W przypadku kwantyfikacji fluorescencji wybrano trzy losowe ROI (25 515 μm²). Ustawiono i wystandaryzowano odejmowanie tła, jasność obrazu i progi kontrastu w całym eksperymencie. Oceniono surową zintegrowaną gęstość fluorescencji. Intensywności fluorescencji tych ROI uśredniono, aby uzyskać pojedynczą średnią wartość intensywności reprezentującą intensywność w strukturze. Kanały niebieski, czerwony i zielony następnie połączono za pomocą oprogramowania ImageJ i Adobe Photoshop 2020, aby utworzyć obraz kompozytowy.

Analizy statystyczne dla badań MWM i immunofluorescencji przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism9. Wszystkie zbiory danych testowano pod kątem rozkładu Gaussa za pomocą testu normalności Shapiro-Wilka przed analizą parametryczną. Do porównania dwóch grup użyto testu t dla prób niezależnych. W przypadku porównań obejmujących trzy lub więcej grup zastosowano zwykłą jednokierunkową ANOVA z analizą post-hoc Tukeya dla wielu porównań. W przypadku porównania danych z czterodniowego treningu MWM użyto powtarzanej dwukierunkowej ANOVA z analizą post-hoc Tukeya dla wielu porównań. Wszystkie dane przedstawiono jako wartości średnie, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Poziom istotności ustalono na P<0,05.

Jak SE wpływa na uczenie się i pamięć przestrzenną?

Optymalizacja dawki pilokarpiny jest ważna dla konsekwentnego zachowania napadowego, które reprezentuje manifestację ciągłego SE. W tym badaniu zastosowano strategie optymalizacji dawki. Obejmowało to ograniczenie skumulowanej dawki maksymalnej i liczby iniekcji dla każdego szczura. Skutecznie wywołano SE u 27 szczurów, z czego 21 (78%) z powodzeniem rozwinęło SE, charakteryzujące się wykazaniem ≥stadium IV według skali Racine’a. 21 szczurów, które rozwinęły SE, zgrupowano w grupie SE_SIV-SV, natomiast kolejne sześć z nieudaną indukcją SE zgrupowano w grupie noSE_SI-SIII. Zwierzęta wykazujące chorobowość SE są predysponowane do wysokich wskaźników śmiertelności. Dlatego w tym badaniu zastosowano ksylazynę i koktajl zawierający diazepam i MK-801.

Najpierw zbadano nabywanie pamięci między różnymi grupami leczenia, używając powtarzanej dwukierunkowej ANOVA do analizy istotnych różnic między zabiegami i dniami treningu dla wszystkich grup. Analiza wykazała istotną różnicę w czasie dotarcia do platformy między różnymi grupami leczenia w całym czterodniowym okresie treningu (P<0,0001). Dalej zbadano istotne różnice między różnymi grupami leczenia dla każdego dnia czterodniowego okresu treningowego, używając testu post-hoc Tukeya dla wielu porównań. Stwierdzono, że już od 1. dnia sesji treningowej szczury SE_SIV-SV (58,96 ± 2,55 s) wykazały znacznie upośledzone uczenie się przestrzenne w porównaniu do szczurów kontrolnych [Dzień 1 (47,03 ± 8,67 s, P<0,05)]. Upośledzenie uczenia się i pamięci pogłębiało się przez pozostałe trzy dni, z których zaobserwowano znacznie dłuższy czas dotarcia do platformy dla SE_SIV-SV [Dzień 2 (57,29 ± 6,63 s), Dzień 3 (54,71 ± 6,58 s) i Dzień 4 (52,14 ± 5,54 s)] w porównaniu do grupy kontrolnej [Dzień 2 (30,54 ± 11,97 s, P<0,01), Dzień 3 (10,93 ± 4,44 s, P<0,01) i Dzień 4 (6,64 ± 1,98 s, P<0,0001)].

Jednak możliwe deficyty uczenia się przestrzennego i pamięci manifestowane przez szczury noSE_SI-SIII nie zostały jeszcze zgłoszone w innych badaniach i pozostają nieuchwytne; dlatego próbowaliśmy zbadać tę niejednoznaczność. Porównawczo, tylko podczas Dnia 3 i Dnia 4 szczury noSE_SI-SIII [Dzień 3 (37,00 ± 14,94 s) i Dzień 4 (27,00 ± 14,56 s)] ujawniły znacznie krótszy czas latencji w porównaniu do ich krewniaków SE_SIV-SV (P<0,05). Nie zgłoszono istotnej różnicy między dwiema grupami przez pierwsze dwa dni treningu. Może to wskazywać, że szczury noSE_SI-SIII wykazały stopniową poprawę w nabywaniu uczenia się przestrzennego i pamięci (tylko wystąpiło począwszy od Dnia 3, a nie tak jak u szczurów SE_SIV-SV), odzwierciedlając znaczną manifestację oszczędzonej funkcji poznawczej przestrzennej u szczurów noSE_SI-SIII. Oszczędzona funkcja poznawcza wyświetlana u szczurów noSE_SI-SIII może być dalej wskazywana przez nieistotną różnicę w czasie latencji między szczurami noSE_SI-SIII a szczurami kontrolnymi przez pierwsze trzy kolejne dni, ale nie w ostatnim dniu, kiedy szczury noSE_SI-SIII wskazały znacznie dłuższy czas dotarcia do platformy w porównaniu do ich krewniaków kontrolnych (P<0,05). Dlatego łącząc te dwa punkty, istotna różnica wykazana w Dniu 3 i 4 między noSE_SI-SIII a SE_SIV-SV, oraz manifestacja oszczędzonej funkcji poznawczej u szczurów noSE_SI-SIII, mogą potwierdzać w zakresie funkcji poznawczej, dlaczego uraz wykazany przez tę grupę może nie być wiarygodny w naśladowaniu modelu i jest szeroko wykluczany w większości eksperymentów.

Jak zolpidem modulował zachowania i funkcje motoryczne?

Następnie oceniono wpływ zolpidemu na odzyskiwanie pamięci przestrzennej (mierzone jako procent czasu spędzonego w docelowym kwadrancie) u szczurów normalnych i z SE. Dodatkowo, używając innych paradygmatów labiryntu wodnego, w tym prędkości pływania w labiryncie i długości ścieżki w strefie peryferyjnej, zmierzono wpływ zolpidemu na funkcje motoryczne i lęk. Aby ocenić wpływ zolpidemu na pamięć odtwarzania u szczurów normalnych i z SE, użyto czasu spędzonego (%) w docelowym kwadrancie południowo-wschodnim (zacienionym na różowo). Zaobserwowano istotną różnicę (P<0,0001) w czasie spędzonym w docelowym kwadrancie między grupami leczenia. Zaobserwowano znaczną redukcję czasu spędzonego w docelowym kwadrancie u Kontrola_Zolpidem (10,39 ± 8,38%) w porównaniu do szczurów normalnych leczonych placebo (25,70 ± 3,58%, P<0,001), jednak nie zaobserwowano istotnej różnicy między szczurami z SE leczonymi zolpidemem (5,00 ± 5,29%) a leczonymi placebo (5,92 ± 3,93%). Szczury SE_Placebo i SE_Zolpidem wykazały znaczną redukcję czasu spędzonego w docelowym kwadrancie w porównaniu do Kontrola_Placebo (P<0,0001). Negatywny efekt pamięciowy zolpidemu w normalnych warunkach był wizualizowany przez upośledzenie strategii wyszukiwania szczurów w porównaniu do zwierząt nieleczonych zolpidemem. Strategie wyszukiwania szczurów z SE leczonych zolpidemem i placebo nie były znacząco różne, ponieważ wykazywały podobne wzorce upośledzonych trajektorii wyszukiwania. W tym przypadku zolpidem nie poprawił procesu odzyskiwania pamięci u szczurów z SE.

Aby ocenić wpływ zolpidemu na zachowania lękopodobne w grupach normalnych i z SE, użyto paradygmatu długości ścieżki (m) w strefie peryferyjnej, zacieniowanej na niebiesko. Jednokierunkowa ANOVA wykazała istotną różnicę (P<0,001) w długości ścieżki w strefie peryferyjnej między grupami leczenia. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w długości ścieżki w strefie peryferyjnej między szczurami leczonymi placebo (4,83 ± 1,92 m) a leczonymi zolpidemem (4,08 ± 1,43 m) w grupie normalnych szczurów. Tor pływania szczurów leczonych zolpidemem nie wykazał zauważalnej różnicy w wzorcu pływania peryferyjnego i był nie do odróżnienia od tego obserwowanego u szczurów leczonych placebo. Odzwierciedla to słabe efekty przeciwlękowe zolpidemu w normalnych warunkach. Ponadto nie zaobserwowano istotnej różnicy między leczeniem placebo a zolpidemem u szczurów z SE. Co więcej, na podstawie toru pływania, leczenie zolpidemem u szczurów z SE nie skutkowało innym wzorcem pływania peryferyjnego w porównaniu do szczurów leczonych placebo. Pokazuje to, że nieistotny efekt przeciwlękowy zolpidemu został zachowany w stanie SE, podobnie jak obserwowano w normalnych warunkach. Zarówno szczury z SE leczone placebo, jak i zolpidemem wykazały znaczny wzrost długości ścieżki w strefie peryferyjnej w porównaniu z Kontrola_Placebo (P<0,01) i Kontrola_Zolpidem (P<0,01).

Aby ocenić wpływ zolpidemu na funkcje motoryczne między grupami, użyto średniej prędkości (ms^-1) w labiryncie wodnym. Zolpidem (0,287 ± 0,072 ms^-1) znacznie upośledzał funkcję motoryczną u normalnych szczurów (test t dla prób niezależnych; 0,37 ± 0,026 ms^-1, t=2,765, df=10, P<0,05), jednak nie u szczurów z SE (SE_Placebo=0,420 ± 0,060 ms^-1 i SE_Zolpidem=0,393 ± 0,092 ms^-1, t=0,5917, df=10; test t dla prób niezależnych). Podkreśla to sedatywne i nasenne działanie zolpidemu u normalnych szczurów, które odzwierciedla się w obecności upośledzenia motorycznego u zwierząt leczonych zolpidemem. Jednak sedatywne i nasenne efekty zależne od zolpidemu nie były obserwowane u szczurów z SE, co może wskazywać, że zolpidem może nie działać jako środek uspokajający lub nasenny w warunkach urazu mózgu.

Czy SE prowadzi do morfologicznych i molekularnych zmian w hipokampie?

Zwykła jednokierunkowa ANOVA wykazała istotne różnice w średniej grubości PCL CA1 różnych grup leczenia (P<0,0001). Analiza post-hoc Tukeya dla wielu porównań wykazała znaczną redukcję średniej grubości PCL CA1 u SE_Placebo (23,11 ± 4,783 μm, P<0,0001) i SE_Zolpidem (24,92 ± 2,717 μm, P<0,0001) w porównaniu do Kontrola_Placebo (42,85 ± 4,909 μm) i grup Kontrola_Zolpidem (43,63 ± 4,909 μm). Tymczasem zaobserwowano istotne różnice w średniej grubości PCL CA3 różnych grup leczenia (P<0,0001). Grupy SE_Placebo (40,80 ± 5,755 μm, P<0,0001) i SE_Zolpidem (38,54 ± 3,814 μm, P<0,0001) wykazały znaczną redukcję średniej grubości w porównaniu do grup Kontrola_Placebo (62,46 ± 6,177 μm) i Kontrola_Zolpidem (65,45 ± 2,469 μm).

W odniesieniu do bezwzględnej liczby komórek, jednokierunkowa ANOVA wykazała również istotne różnice zarówno w PCL CA1, jak i CA3 między grupami leczenia (P<0,0001). Stwierdzono znaczną redukcję bezwzględnej liczby komórek w grupach SE_Placebo (34,60 ± 3,627, P<0,0001) i SE_Zolpidem (35,50 ± 3,646, P<0,0001) w porównaniu do grup Kontrola_Placebo (57,06 ± 2,797) i Kontrola_Zolpidem (58,00 ± 3,425). Podobnie, grupy SE_Placebo (22,90 ± 1,853, P<0,0001) i SE_Zolpidem (20,33 ± 2,102, P<0,0001) wykazały znaczną redukcję bezwzględnej liczby komórek w PCL CA3 w porównaniu do grup Kontrola_Placebo (42,03 ± 3,529) i Kontrola_Zolpidem (44,17 ± 4,284).

Zwykła jednokierunkowa ANOVA wykazała istotną różnicę w ekspresji KCC2 w PCL CA1 między różnymi grupami leczenia (P<0,001). Zaobserwowano znaczną redukcję ekspresji KCC2 w SE_Placebo (7,907 × 10⁷ ± 4,582 × 10⁷a. u.) w porównaniu do Kontrola_Placebo (1,604 × 10⁸ ± 3,137 × 10⁷a. u., P<0,001). Ekspresja białka NKCC1 w PCL CA1 była istotnie różna między grupami (P<0,0001). Zaobserwowano znaczny wzrost surowej zintegrowanej gęstości białka NKCC1 w SE_Placebo (1,175 × 10⁸ ± 3,885 × 10⁷a. u.) w porównaniu do Kontrola_Placebo (5,812 × 10⁷ ± 2,552 × 10⁷a. u., P<0,001). Dodatkowo, stwierdzono, że SE_Zolpidem (6,872 × 10⁷–3,960 × 10⁷a. u.) wykazało znaczny spadek ekspresji NKCC1 w porównaniu do SE_Placebo (P<0,01).

Zwykła jednokierunkowa ANOVA wykazała istotne różnice w ekspresji białka KCC2 w PCL CA3 różnych grup leczenia (P<0,0001). Analiza porównań wielokrotnych wykazała znaczną redukcję ekspresji KCC2 w PCL CA3 u SE_Placebo (8,228 × 10⁷ ± 4,341 × 10⁷a. u.) w porównaniu do Kontrola_Placebo (1,580 × 10⁸ ± 1,469 × 10⁷a. u., P<0,001). Ponadto, SE_Zolpidem (9,208 × 10⁷ ± 4,126 × 10⁷a. u.) wykazało znacznie zmniejszoną ekspresję białka KCC2 w porównaniu do Kontrola_Placebo (P<0,001) i również do Kontrola_Zolpidem (P<0,01). Zanotowano istotną różnicę w ekspresji NKCC1 w komórkach CA3 (P<0,0001). Zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji NKCC1 w SE_Placebo (1,227 × 10⁸ ± 3,245 × 10⁷a. u.) w porównaniu do Kontrola_Placebo (6,629 × 10⁷ ± 2,936 × 10⁷a. u., P<0,001). Ponadto, stwierdzono, że SE_Zolpidem (5,827 × 10⁷ ± 2,062 × 10⁷a. u.) wykazało znacznie zmniejszoną ekspresję NKCC1 w porównaniu do SE_Placebo (P<0,001).

Dlaczego zolpidem nie poprawił pamięci w warunkach urazu?

Liczne badania wykazały, że zolpidem wywiera znaczący negatywny wpływ na pamięć zarówno u ludzi, jak i szczurów. Zgodnie z naszymi ustaleniami, podanie zolpidemu przed próbą końcową upośledza odzyskiwanie pamięci u normalnych szczurów. Mimo potwierdzenia amnestycznego efektu zolpidemu, wyniki te kontrastują z tymi z badań pokazujących, że zolpidem nie powoduje deficytów odzyskiwania pamięci. Na przykład, wykazano, że zolpidem nie upośledzał odzyskiwania pamięci w zadaniu PM-DAT (plus maze discriminative avoidance task). Ta niespójność może wynikać z różnych mechanizmów, za pomocą których zolpidem wpływa na różne aspekty pamięci. Podobnie jak MWM, PM-DAT jest również używany do oceny uczenia się i pamięci; jednak każde zadanie ocenia różne aspekty pamięci: MWM ocenia pamięć przestrzenną (zależną od hipokampa), podczas gdy PM-DAT ocenia uczenie się i pamięć związane ze strachem i lękiem (niezależne od hipokampa). Na podstawie naszych ustaleń sugerujemy, że zolpidem jest szczególnie selektywny lub wrażliwy na hipokamp i jego funkcje.

U szczurów z SE stwierdziliśmy, że zolpidem nie wpływał znacząco na odzyskiwanie pamięci, ponieważ ani nie poprawiał, ani nie pogarszał upośledzonej pamięci. Ponadto, ostre leczenie zolpidemem u szczurów z SE nie poprawiło strategii wyszukiwania ani trajektorii pływania. Sugeruje to, że upośledzenie pamięci wywołane zolpidemem nie jest widoczne w warunkach urazu, prawdopodobnie z powodu utraty funkcji mechanizmów, które pośredniczą w działaniu zolpidemu.

Przy ocenie wpływu ostrego podania zolpidemu na zachowania lękopodobne stwierdziliśmy, że zolpidem miał nieistotny efekt przeciwlękowy u normalnych szczurów. Jest to widoczne w braku redukcji długości ścieżki na obwodzie basenu wśród zwierząt leczonych zolpidemem. Ten minimalny efekt przeciwlękowy zaobserwowano również u szczurów z SE. Nasze ustalenia są zgodne z wynikami wcześniejszych badań, sugerującymi, że zolpidem wywiera nieistotny efekt przeciwlękowy u zwierząt. Strach i lęk są szeroko powiązane z podjednostką α2 GABAAR, do której zolpidem ma słabe powinowactwo. Może to wyjaśniać minimalne efekty przeciwlękowe zolpidemu zaobserwowane w tym badaniu.

Aby ocenić wpływ ostrego podania zolpidemu na funkcje motoryczne, użyto średniej prędkości pływania. To podejście zostało użyte do oceny funkcji motorycznych w zadaniu MWM. Zolpidem znacząco upośledzał funkcje motoryczne u normalnych szczurów, co potwierdza jego działanie sedatywne i nasenne. Zwierzęta poddane sedacji wykazywały upośledzone funkcje motoryczne, reprezentowane przez znaczną redukcję prędkości pływania. Nasze dane są zgodne z innymi badaniami pokazującymi, że zolpidem znacząco redukuje aktywność motoryczną ze względu na jego sedatywne/nasenne działanie na selektywną dla α1 podjednostkę GABAAR. Efekt sedatywny zolpidemu nie był obserwowany u szczurów z SE. Może to wynikać z naruszenia mechanizmów pośredniczących w efekcie sedatywnym/nasennym w stanie SE, takich jak zakłócenie ekspresji podjednostki α1 i jej związanej funkcji.

Czy zolpidem ma działanie neuroprotekcyjne w urazie hipokampa?

SE wywołany przez pilokarpinę został powiązany z urazem hipokampa i histopatologią, szczególnie w podregionach CA1 i CA3. Konsekwentnie zaobserwowaliśmy, że oba regiony hipokampa w grupie SE_Placebo wykazały znaczną redukcję zarówno grubości warstwy komórkowej, jak i bezwzględnej liczby komórek w porównaniu do grupy Kontrola_Placebo. Zdezorganizowana architektura warstwy komórkowej i skondensowane barwienie jądrowe, odzwierciedlone przez obecność komórek pyknotycznych i apoptotycznych, szczególnie w podregionach CA1 i CA3, dodatkowo potwierdziły znaczny zakres urazu neurologicznego spowodowanego przez SE. Jednak nasze badanie wskazało, że zolpidem nie wykazuje działania neuroprotekcyjnego przeciwko śmierci neuronów w urazie wywołanym przez SE, o czym świadczy brak istotnych różnic w grubości warstwy komórkowej i liczbie komórek.

Następnie oceniliśmy potencjalne efekty zolpidemu na ekspresję białek KCC2 i NKCC1 w podregionach CA1 i CA3. SE wywołany pilokarpinąspowodował znaczną downregulację ekspresji KCC2 w hipokampie w porównaniu do zwierząt Kontrola_Placebo. Potwierdziło to utrzymywanie się downregulacji KCC2 w urazie neurologicznym wywołanym przez SE, 24 dni po indukcji SE. Nasze dane rozszerzają również ustalenia innych badaczy, którzy zgłosili utrzymującą się downregulację KCC2 w hipokampie 14 dni po indukcji SE. Dodatkowo, ekspresja KCC2 była znacznie downregulowana 45 dni po indukcji SE. Dlatego nasze ustalenia, wraz z ustaleniami innych badań, potwierdzają długoterminową downregulację ekspresji KCC2 w różnych punktach czasowych po indukcji SE.

Ponadto, nasze wyniki ujawniły, że podanie zolpidemu nie przywróciło dysregulowanej ekspresji KCC2 w urazie hipokampa w podregionach CA1 i CA3, ponieważ ekspresja KCC2 była nie do odróżnienia między szczurami leczonymi zolpidemem a leczonymi placebo z SE. Mimo nieistotnej upregulacji w CA1 w porównaniu do szczurów z SE leczonych placebo, zaobserwowaliśmy zwiększony wzorzec ekspresji KCC2 podobny do tego u szczurów kontrolnych, co może wskazywać na pewien poziom przywrócenia w tym podregionie. Jednak ostre podanie zolpidemu może nie być wystarczające do upregulacji lub przywrócenia globalnej ekspresji KCC2 w hipokampie do normalnych poziomów.

Wcześniejsze badania wykazały, że przewlekłe podawanie zolpidemu znacząco upregulowało ekspresję KCC2 w przodomózgowiu limbicznym normalnych myszy. Nasze ustalenia dotyczące potencjalnego zaangażowania zolpidemu w pośredniczenie w upregulacji KCC2 są zgodne z tymi badaniami. Jednak nasze dane wykazały rozbieżność w zmianach ekspresji KCC2 po ostrym leczeniu zolpidemem. Te kontrastujące wyniki mogą wynikać z odmiennych warunków komórkowych i funkcjonalnych między dwoma badaniami przed leczeniem zolpidemem. Zolpidem podano zwierzętom z urazem SE, podczas gdy w innych badaniach badano normalne zwierzęta, co prowadziło do potencjalnie niekompatybilnych warunków komórkowych i fizjologicznych.

Jak zolpidem wpływa na ekspresję transporterów ionowych?

W odniesieniu do NKCC1, konsekwentnie obserwowaliśmy długoterminową upregulację NKCC1 w obu podregionach hipokampa u szczurów z SE 24 dni po indukcji SE. To ustalenie jest zgodne z innym badaniem, które zgłosiło utrzymującą się upregulację NKCC1 w hipokampie 45 dni po indukcji SE. Kluczowym ustaleniem naszego badania było to, że zolpidem konsekwentnie redukował lub przywracał ekspresję NKCC1 u szczurów, konsekwentnie w obu podregionach hipokampa.

Jednym z potencjalnych mechanizmów jest to, że zolpidem, działając jako pozytywny modulator allosteryczny GABAAR, mógłby pośrednio wpływać na ekspresję NKCC1 poprzez modulowanie aktywności neuronalnej i przywracanie równowagi między pobudzającą a hamującą neurotransmisją. Ponieważ aktywacja GABAAR zazwyczaj prowadzi do napływu Cl^–, zolpidem może wzmacniać sygnalizację hamującą, co mogłoby następnie zmieniać homeostazę transporterów jonowych, takich jak NKCC1, zaangażowanych w utrzymanie gradientów Cl^– w neuronach. Dodatkowo, modulacja GABAAR przez zolpidem może wywołać szlaki sygnalizacyjne, które dalej wpływają na ekspresję NKCC1. Na przykład, zmiany w wewnątrzkomórkowych poziomach Cl^– lub zmiany w sygnalizacji wapniowej, na które wpływa aktywność GABAAR, mogłyby służyć jako sygnały do regulacji transkrypcyjnej lub posttranskrypcyjnej NKCC1.

Wcześniejsze badania wykazały, że przesunięcia w gradientach Cl^– mogą wpływać na aktywność transporterów jonowych, takich jak NKCC1 i KCC2, które są kluczowe dla utrzymania funkcji synaptycznej i pobudliwości neuronalnej. Dlatego działanie zolpidemu na GABAAR może wywołać kaskadę wewnątrzkomórkowych zdarzeń, ostatecznie modulując NKCC1 na poziomie molekularnym. Te potencjalne mechanizmy wymagają dalszych badań, ponieważ mogłyby zapewnić głębszy wgląd w szerszą rolę GABAAR w regulowaniu równowagi pobudzająco-hamującej i transportu jonów w mózgu.

Jakie ograniczenia ujawnia badanie wpływu zolpidemu?

Ważne jest, aby zauważyć, że rola GABAAR nie była badana w tym badaniu ze względu na kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, włączenie diazepamu do protokołu leczenia, który również działa jako pozytywny modulator GABAAR, komplikuje bezpośrednie badanie blokady receptorów. Mechanizm działania diazepamu wzmacnia sygnalizację GABAergiczną, co utrudnia izolowanie efektów inhibicji receptorów bez zmiany ogólnej dynamiki leczenia. Dodatkowo, zakłócanie hamowania GABAergicznego podczas napadów potencjalnie nasiliłoby ciężkość napadów i zwiększyło uszkodzenie neuronów. To potencjalne ryzyko, w połączeniu z wyzwaniami w izolowaniu efektów specyficznych dla receptorów w obecności diazepamu, doprowadziło nas do decyzji o niezbadaniu blokady GABAAR w tym badaniu.

Jednak przywrócenie NKCC1 zależne od zolpidemu w hipokampie nie było związane z poprawą uczenia się lub pamięci. Może to wynikać z nieadekwatnej regeneracji komórkowej, w której białka inne niż NKCC1 muszą być przywrócone dla poprawy behawioralnej. Alternatywnie, przywrócenie samego NKCC1, bez jednoczesnego przywrócenia KCC2, i prawdopodobnie bez przywrócenia homeostazy Cl^–, może leżeć u podstaw braku pozytywnych efektów zolpidemu na zaburzenia behawioralne po urazie neurologicznym. To założenie jest poparte badaniami klinicznymi zgłaszającymi, że pacjenci z urazami mózgu, którym wcześniej przepisano zolpidem, nie wracali do zdrowia z zaburzeń behawioralnych po spożyciu zolpidemu.

Do tej pory żadne badania nie badały specyficznie potencjalnych efektów regeneracyjnych zolpidemu na upregulację NKCC1 po urazie neurologicznym. Kilka badań zgłosiło znaczne redukcje upregulacji NKCC1 w modelach zwierzęcych niedotlenienia niedokrwiennego, padaczki skroniowej i traumatycznego urazu mózgu po podaniu witeksyny, bumetanidu, BDNF i astaksantyny. Jednak mechanizmy leżące u podstaw efektów regeneracyjnych zolpidemu na zmienioną ekspresję NKCC1 w urazie neurologicznym pozostają niejasne, a dowody eksperymentalne są ograniczone.

Co wynika z niniejszych ustaleń?

Dlatego dalsze badania są wymagane, aby wyjaśnić molekularne mechanizmy i szlaki, poprzez które zolpidem pośredniczy w downregulacji NKCC1 w urazie neurologicznym. Zrozumienie tych potencjalnych mechanizmów, w tym roli zolpidemu w przywracaniu ekspresji lub funkcji NKCC1 i jego pośredniego zaangażowania w przywracanie dysregulacji Cl^–, może pomóc wyjaśnić niespójne wyniki kliniczne związane z paradoksalnymi efektami zolpidemu w urazie neurologicznym.

Nasze badanie in vivo nie wykazało żadnej poprawy uczenia się lub pamięci po podaniu zolpidemu w przypadkach urazu mózgu. Dodatkowo, ostre podanie zolpidemu nie wpłynęło na patologię hipokampa w urazie mózgu, ponieważ wyniki te nie były porównywalne z wynikami u zwierząt leczonych placebo. Co godne uwagi, ostre podanie zolpidemu przywróciło ekspresję NKCC1 w hipokampie, jednak nie ekspresję KCC2. Z tych obserwacji możemy wnioskować, że przywrócenie samego NKCC1 może nie być wystarczające do ułatwienia zależnego od zolpidemu powrotu do zdrowia, szczególnie w uczeniu się i pamięci, w warunkach urazowych. Ponadto, nasze ustalenia sugerują, że zolpidem ma potencjał do przywracania ekspresji białek, przynajmniej w hipokampie.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie koncentrowało się na ocenie wpływu zolpidemu na funkcje poznawcze po stanie padaczkowym (SE). Status epilepticus wywołano u szczurów przy użyciu pilokarpiny, a następnie analizowano efekty podawania zolpidemu na pamięć przestrzenną, zachowania lękowe i funkcje motoryczne. Badanie wykazało, że SE prowadzi do znacznego upośledzenia funkcji poznawczych oraz zmian w strukturze hipokampa, w tym redukcji grubości warstwy komórkowej i liczby neuronów. Zolpidem nie poprawił pamięci ani uczenia się u zwierząt z SE, mimo że przywrócił ekspresję transportera NKCC1 w hipokampie. Nie zaobserwowano również istotnego wpływu na ekspresję transportera KCC2. W warunkach normalnych zolpidem wykazywał działanie sedatywne i upośledzał funkcje motoryczne, jednak efekt ten nie występował u zwierząt z SE. Badanie sugeruje, że samo przywrócenie ekspresji NKCC1 może być niewystarczające do poprawy funkcji poznawczych po urazie mózgu, wskazując na potrzebę dalszych badań nad mechanizmami działania zolpidemu w kontekście regeneracji neurologicznej.